ООО "Селл Диагностик"

EngАдрес офиса: 220040, г. Минск, ул.Некрасова, д.35, корп. 1, пом. 1Н Пн.-Пт.: 09:00 - 18:00

+375 29 3 911 690

Динамика фрагментации ДНК сперматозоидов

Набор dyn-halosperm

Набор dyn-halosperm® представляет собой диагностический тест для определения уровня фрагментации ДНК сперматозоидов. Данный диагностический набор позволяет установить уровни фрагментации ДНК сперматозоидов в динамике, т.е. в разные моменты времени после сбора эякулята (например, через 0, 1, 2, 6 ч). Качество эякулята – не постоянная величина, и по прошествии времени оно может изменяться и ухудшаться. В экспериментах установлено, что дополнительные, ятрогенные, повреждения ДНК могут появляться уже через 15 минут после эякуляции. Оценка динамического изменения фрагментации ДНК сперматозоидов важна для выбора тактики лечения пациента с бесплодием и методики ВРТ. В случае, если уровень фрагментации ДНК высок или рост фрагментации очень быстр, то рекомендуется проводить обработку спермы / использовать ее как можно скорее (например, отказаться от ВМИ или ЭКО в пользу ИКСИ).

В состав набора входят красители для светлопольной микроскопии для окрашивания препарата; реагенты набора разлиты во флаконы-капельницы для удобства обращения с набором и проведения продопобготовки.

Набор на фрагментацию ДНК сперматозоидов dyn-halosperm® базируется на технологии SCD (дисперсия хроматина сперматозоидов). Методика основана на контролируемой денатурации ДНК сперматозоидов и удалении ядерных белков. Принцип технологии заключается в том, что сперматозоиды с фрагментированной ДНК не создают характерный ореол (гало) диспергированных петель ДНК, который наблюдается у сперматозоидов с целостной, неповрежденной ДНК.

Анализ динамики фрагментации ДНК является процессом, по сути воспроизводящим воздействие течения времени на качество ДНК, когда сперматозоиды инкубируются с ооцитом. Данный процесс схож с происходящим во время процедуры ЭКО или ВМИ. В тесте dyn-halosperm образец спермы готовят к использованию и инкубируют при 37 ºС в инкубаторе или водяной бане.

Почему важно определение динамики фрагментации ДНК?

В настоящее время возрастает интерес к изучению динамики фрагментации ДНК, поскольку образцы спермы после эякуляции, ex vivo, могут получать дополнительные ятрогенные повреждения ДНК, которые значительно различаются между пациентами. Было показано, что фрагментация ДНК сперматозоидов присутствует во время эякуляции, и возрастает со временем. Устойчивость (долговечность) ДНК различна у различных пациентов. В клинических условиях ВРТ для избежания дополнительных ятрогенных повреждений образцов спермы необходимо выявлять пациентов с высокими базовыми уровнями фрагментации ДНК и пациентов, у которых фрагментация быстро возрастает со временем.
Набор dyn-halosperm® позволяет клиническим специалистам получить дополнительную информацию для выбора репродуктивной методики, наилучшим образом подходящей каждой паре. Например, для пациента с высокой скоростью роста уровня фрагментации ДНК после эякуляции рекомендуется применять подходы ВРТ, обеспечивающие короткие интервалы манипуляций in vitro и быстрое оплодотворение ооцита.

Набор dyn-halosperm® полезен для выбора оптимальных временных интервалов цикла ВРТ, оценки качества образца спермы и получения ответов в случаях идиопатического бесплодия или неоднократных выкидышей.

dyn-halo-graph

Пример разграничения образцов эякулята с различной устойчивостью (долговечностью) ДНК.

Красная линия: пациент с изначально низким уровнем фрагментации ДНК после эякуляции, но с высокой скоростью роста фрагментации ДНК. Низкая устойчивость ДНК.

Синяя линия: пациент с изначально низким уровнем фрагментации ДНК после эякуляции, и с низкой скоростью роста фрагментации ДНК. Высокая устойчивость ДНК.

В первом случае необходим выбор быстрой процедуры ВРТ для избежания дополнительного ятрогенного повреждения ДНК. Во втором случае рост повреждений ДНК не так значителен, и обработка образца и используемый метод могут быть адаптированы соответственно.

Набор рассчитан на выполнение 5 тестов (каждый тест включает себя 4 точки (времени инкубации) определения уровня фрагментации ДНК).

Срок годности: набор dyn-halosperm имеет срок годности 1 год с момента производства, а после первого вскрытия набора – 9 мес.

Условия хранения: набор следует хранить в холодильнике при температуре от 2 ºС до 8 ºС. Непосредственно перед исследованием реагенты рекомендуется доводить до комнатной температуры.

Данный тест является вспомогательным средством в диагностике. Интерпретация результатов проводится по медицинским критериям.

Для проведения теста Вам понадобятся:
  • cветлопольный микроскоп
  • холодильник (4 ºС), стеклянная/металлическая пластина/поднос
  • водяная баня для инкубации при 37 ºС
    - Вместо водяной бани может использоваться суховоздушный инкубатор/термошкаф
    - Также вместо водяной бани может использоваться твердотельный нагреватель для пробирок (часто используется для ПЦР).
  • водяная баня для инкубации при 95-100 ºС
    - Вместо водяной бани можно использовать твердотельный нагреватель для пробирок (часто используется для ПЦР) / термошейкер, установленный на температуру 95-99 °С.
    - Также вместо водяной бани можно использовать печь СВЧ мощностью 600 Вт
  • покровные стекла (24х24 мм),
  • микропипетки и наконечники к ним
  • чашки Петри или аналогичные емкости
  • одноразовые пипетки
  • дистиллированная вода
  • этанол 70 % и 100 % (допускается использование 96 % медицинского спирта, но не менее 95%).
Как выглядят получаемые образцы после пробоподготовки

При анализе результатов в клинической лаборатории под микроскопом сперматозоиды выглядят следующим образом (при использовании светлопольных красителей):

human

Ф – фрагментированная ДНК

НФ – нефрагментированная ДНК

* - деградированный сперматозоид

Тест dyn-halosperm также позволяет выявить деградированные сперматозоиды (сперматозоиды с крайней степенью фрагментации), отмечен на фото выше символом «*». Процентное содержание деградированных (degraded) сперматозоидов в образце при проведении теста может указывать на скрытое течение варикоцеле у пациента [Esteves et al., Int Urol Nephrol (2015) 47:1471–1477; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26228577], в случае, если % деградированных сперматозоидов ≥33% от числа всех фрагментированных сперматозоидов.

Деградир сперм

Деградир сперм образец 2

При использовании флуоресцентных красителей результаты выглядят следующим образом:

fluogreen

fluorored1

Принцип метода

Тест на фрагментацию ДНК сперматозоидов dyn-halosperm® базируется на запатентованной компанией HALOTECH технологии Sperm Chromatin Dispersion / SCD (дисперсия хроматина сперматозоидов). Методика основана на контролируемой денатурации ДНК сперматозоидов и удалении ядерных белков. Принцип технологии заключается в том, что сперматозоиды с фрагментированной ДНК не создают характерный ореол (гало) диспергированных петель ДНК, который наблюдается у сперматозоидов с целостной, неповрежденной ДНК.

Интактную нефиксированную сперму (свежие, замороженные/размороженные разведенные образцы) погружают в инертный агарозный микрогель на предварительно обработанном предметном стекле. Начальная кислотная обработка денатурирует ДНК в сперматозоидах с фрагментированной ДНК. После этого лизирующий раствор удаляет большинство ядерных белков. При наличии массивных разрывов ДНК нуклеоиды из сперматозоидов с фрагментированной ДНК либо не показывают ореола (гало) дисперсии, либо ореол (гало) минимальный.

Образец для анализа:

Тест проводится на нативных образцах спермы или на отмытых сперматозоидах (например, на образцах, предназначенных для использования в процедурах ВРТ).

Свежие образцы спермы следует собирать в стерильные контейнеры. Анализ фрагментации ДНК сперматозоидов следует проводить сразу после получения образца спермы, или после размораживания образца после криоконсервации.
Перед анализом образец нативной спермы следует разжижать не более 30 минут при 37 °С.

- Степень фрагментации ДНК сперматозоидов не является статическим показателем спермы, и может изменяться (возрастать) со временем в силу как характерных для образца спермы причин, так и в силу воздействия внешних факторов. Образец спермы для анализа, после его разжижения, если образец не подвергается анализу на фрагментацию ДНК незамедлительно, нужно поместить и хранить в морозильнике при -20 °С (до 15 дней) (во избежание температурного повреждения ДНК); или провести процедуру криоконсервации.

- Перед использованием в тесте замороженный образец спермы необходимо разморозить (при 37 °С в водяной бане или инкубаторе, или в соответствии с использованным методом криоконсервации), а затем незамедлительно начать проведение теста.

- Для исследования рекомендуется разводить образец спермы до концентрации менее 20 млн/мл в соответствии с инструкцией по применению. Для разбавления можно использовать среду для промывки сперматозоидов, PBS (ФСБ – фосфатно-солевого буфера) или 0,9% физраствор.

Оценка (градация) результатов теста на фрагментацию ДНК сперматозоидов

Индекс фрагментации ДНК (DFI) сперматозоидов (процентное содержание сперматозоидов с фрагментированной ДНК) в нативной сперме [Gosalvez et al., J Reproduct Biotech Fertil 2015; 4:1–16; https://journals.sagepub.com/doi/abs/10.1177/2058915815594454]:

  • < 15 %: норма (низкий DFI)
  • 15 – 30 %: средняя степень фрагментации ДНК (средний DFI)
  • > 30 %: высокая степень фрагментации ДНК (высокий DFI)

Уровень фрагментации ДНК выше 30 % рассматривается в качестве высокого, и считается, что присутствует выраженный мужской фактор, ассоциированный с репродуктивной неудачей. Высокая фрагментация ДНК сперматозоидов значительно снижает вероятность беременности при естественном зачатии и при проведении внутриматочной инсеминации, повышает риски потери беременности после процедур ЭКО и ИКСИ.

HT-DHS5G2 Набор диагностических реагентов для анализа ДНК сперматозоидов – dyn-halosperm

Инструкция по применению набора dyn-halosperm на русском языке скачать

Инструкция по применению набора dyn-halosperm на английском языке скачать

Для получения более подробных практических рекомендаций по проведению теста и анализу результатов обратитесь к специалистам компании «Селл Диагностик».

Видеоинструкция по применению набора dyn-halosperm

Вопрос 1: Почему важно знать информацию о динамике фрагментации ДНК сперматозоидов?

В настоящее время возрастает интерес к изучению динамики фрагментации ДНК, поскольку образцы спермы после эякуляции, ex vivo, могут получать дополнительные ятрогенные повреждения ДНК, которые значительно различаются между пациентами. Было показано, что фрагментация ДНК сперматозоидов присутствует во время эякуляции, и возрастает со временем. Устойчивость (долговечность) ДНК различна у различных пациентов. В клинических условиях ВРТ для избежания дополнительных ятрогенных повреждений образцов спермы необходимо выявлять пациентов с высокими базовыми уровнями фрагментации ДНК и пациентов, у которых фрагментация быстро возрастает со временем.

Информация о динамике фрагментации ДНК важна клиническим специалистам для выбора репродуктивной методики, наилучшим образом подходящей каждой паре. Например, для пациента с высокой скоростью роста уровня фрагментации ДНК после эякуляции рекомендуется применять подходы ВРТ, обеспечивающие короткие интервалы манипуляций in vitro и быстрое оплодотворение ооцита.

Вопрос 2: Сколько времени требуется для получения результатов с помощью набора dyn-halosperm?

Пробоподготовка и проведение, включая анализ результатов, теста на фрагментацию ДНК dyn-halosperm в лаборатории занимает приблизительно 60-70 мин (без учета времени разжижения образца спермы и без учета времени инкубации образцов для динамической оценки).

Вопрос 3: Влияет ли криоконсервация или замораживание на ДНК сперматозоидов?

Замораживание образцов в жидком азоте не изменяет уровень фрагментации ДНК сперматозоидов при условии незамедлительного анализа на фрагментацию ДНК после размораживания, поэтому тест можно проводить на замороженных образцах, которые затем можно использовать в различных вспомогательных репродуктивных технологиях. Также для целей анализа на фрагментацию ДНК допускается замораживание и хранение образцов сжиженной спермы в морозильной камере при -20°С в течение <15 дней. После размораживания образцы следует использовать незамедлительно, чтобы избежать повышения уровня повреждений ДНК.

Вопрос 4: Как готовить образец спермы к исследованию?

Перед анализом образец нативной спермы следует разжижать не более 30 минут при 37 °С после сдачи образца.

- Настоятельно рекомендуется фиксировать в лабораторных записях/бланках ответа время, прошедшее от момента забора образца до начала проведения теста (начала пробоподготовки). Степень фрагментации ДНК сперматозоидов не является статическим показателем спермы, и может изменяться (возрастать) со временем в силу как характерных для образца спермы причин, так и в силу воздействия внешних факторов. Образец спермы для анализа, после его разжижения, если образец не подвергается анализу на фрагментацию ДНК незамедлительно, нужно поместить и хранить в морозильнике при -20 °С (до 15 дней) (во избежание температурного повреждения ДНК). Перед использованием в тесте замороженный образец спермы необходимо разморозить (37 °С в водяной бане или инкубаторе), а затем незамедлительно начать проведение теста.

- Для исследования рекомендуется разводить образец спермы до концентрации менее 20 млн/мл в соответствии с инструкцией по применению. Для разбавления можно использовать среду для промывки сперматозоидов, PBS (ФСБ – фосфатно-солевого буфера) или 0,9% физраствор.

Вопрос 5: Что делать в случае патологической вязкости образца спермы?

В случае патологической вязкости образца спермы, если разжижение не происходит за 15-25 мин, рекомендуется выполнить 1 из следующих действий для снижения вязкости образца:

а) Разбавить образец средой для промывки сперматозоидов: Добавьте к нативному образце спермы равный объем среды, например, среды FertiCult Flushing medium (FertiPro N.V., Бельгия), аккуратно перемешайте пипеткой. Либо, в случае, если рекомендация а) не привела к желаемому результату.

б) Добавьте к нативному образце спермы равный объем среды, например, среды FertiCult Flushing medium (FertiPro N.V., Бельгия), аккуратно перемешайте пипеткой. Центрифугируйте на протяжении 5 мин (300 g, либо 1500 об/мин), удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в необходимом объеме среде FertiCult Flushing medium.

в) В некоторых случаях вязкость нативного образца спермы может быть снижена с помощью неоднократного (6-10 раз) аккуратного пропускания образца спермы через шприц с тупоконечной иглой 18G (внутренний диаметр 0.84 мм) или 19G (внутренний диаметр 0.69 мм).

Вопрос 6: В чем состоят преимущества теста dyn-halosperm® на фрагментацию ДНК сперматозоидов?

Тест позволяет оценить устойчивость ДНК к разрушению (фрагментации) со временем после эякуляции, что важно для подбора приемлемой процедуры ВРТ в случае неустойчивой ДНК (например, если скорость роста фрагментации ДНК составляет >4%/ч на протяжении первых 3 ч инкубации, рекомендуется применять процедуру ИКСИ) и адаптации протокола обработки спермы.

- Метод выявляет как одноцепочечные, так и двухцепочечные повреждения ДНК.

- Быстрое получение результатов теста: в лаборатории проведение теста занимает около 70 минут.

- Методика выполнения теста является точной, воспроизводимой, валидированной в соответствии с европейскими требованиями; тесты семейства halosperm® используются в клинических диагностических лабораториях и ведущих центрах вспомогательной репродукции человека более чем в 50 странах мира, в т.ч. ЕС, США, Канаде, Японии.

- Производитель набора halosperm® G2, компания HALOTECH DNA S.L. (Испания), является ведущей компанией-разработчиком наборов для диагностики бесплодия, обладает патентами на технологию SCD и всеми необходимыми сертификатами качества (ISO 13485:2016) и лицензиями в соответствии с законодательством ЕС и Испании, обеспечивает строгий контроль качества наборов. Компания постоянно оказывает научную и техническую поддержку лабораториям и центрам, использующим производимые ею наборы, и на постоянной основе реализует научные исследования в области фрагментации ДНК сперматозоидов. На основе научных исследований компания разрабатывает рекомендации клиническим специалистам по ведению пациентов с высоким уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов, возможностям снижения уровня фрагментации ДНК.

- Фрагментация ДНК сперматозоидов в образце не является статичным, неизменным показателем, и может существенно изменяться во времени даже после сдачи образца спермы (например, из-за воздействия внешних факторов, таких как температура, а также из-за внутренних особенностей конкретного образца). Лаборатория, в которой проводится анализ, имеет возможность обеспечить полный контроль за образцом спермы на преаналитическом этапе (до выполнения анализа), что крайне важно для точной и правильной оценки уровня фрагментации ДНК сперматозоидов и исключения воздействия факторов, влияющих на фрагментацию ДНК образца спермы после его сдачи.

Вопрос 7: В каких случаях рекомендуется назначать тест на фрагментацию ДНК сперматозоидов?

Анализ фрагментации ДНК сперматозоидов особенно рекомендован:

  • парам с выкидышами, невынашиванием беременности в анамнезе;
  • парам с идиопатическим бесплодием на протяжении более 6 месяцев;
  • мужчинам старше 40 лет;
  • в случае низкого качества эмбрионов;
  • в случае неудачных попыток ЭКО и других вспомогательных репродуктивных технологий в анамнезе;
  • в случае мужского фактор неизвестной природы;
  • мужчинам с онкологическими заболеваниями в анамнезе;
  • мужчинам, проходящим лечение рецептурными лекарственными средствами, которые могут оказывать влияние на репродуктивную систему;
  • мужчинам, подверженным воздействию токсичных веществ на работе;
  • мужчинам, у которых выявлялись урогенитальные инфекции;
  • мужчинам с нездоровым образом жизни: курением, сидячим образом жизни, несбалансированным питанием или ожирением.

Для поиска по Реестру медицинской техники и изделий медицинского назначения Республики Беларусь в поле «Производитель» укажите «HALOTECH»

Реестр изделий медицинского назначения Республики Беларусь