Часто задаваемые вопросы Synthecon

Что за переключатель на задней панели блока питания ?

Данный переключатель является тумблером «низкая-высокая скорость», который изменяет диапазоны скоростей. При положении тумблера «опущен вниз» (как на фото ниже) прибор будет работать на низких скоростях (6-16 об/мин), а при положении тумблера «поднят вверх» прибор будет работать на высоких скоростях (16-38 об/мин).

Переключать данный тумблер можно при включенном приборе.

Что за кнопки “SEL” и “RST” на лицевой панели блока питания ?

Данные кнопки заблокированы и не должны использоваться пользователем.

Что за черный маленький штырек около регулятора оборотов (тахометра) ?

Этот штырек предназначен для блокировки поворотного регулятора и для предотвращения смещения его установленного значения. Если нажать на этот штырек, он заблокирует регулятор, а если потянуть его на себя, он разблокирует регулировку (регулятор сможет вращаться).

Оксигенаторная мембрана: ни в коем случае не касаться ее пипеткой (будет прокол — протекание)

«Подвергая сосуд сильному вакууму, с усилием вытягивая поршни шприцев, прикрепленных к портам, можно разорвать мембрану оксигенатора и потребует ее замены»

Необходимо открывать второй кран (для обеспечения притока воздуха для замещения жидкости в нем газом) при отборе среды/клеток из сосуда с помощью шприца из первого крана. Не допускается герметизация/создание сильного вакуума !!!

Порт для наполнения (Fill port):

предназначен для добавления среды/клеток и аспирации среды/клеток (в STLV и больших HARV (50 мл, 10 мл). Не обязательно использовать шприцевые порты для удаления всей среды/отбора клеток.

Малые HARV: отбор осуществляется только шприцем. Можно использовать 5-мл шприц для извлечения среды (всего объема) из крана. Второй кран при этом необходимо открывать для доступа воздуха.

Из какого отверстия в STLV отбирать клетки? Чем отбирать? И надо ли наклонять (и на какой угол) сосуд для того, чтобы отобрать клетки ?

Отбирать клетки – из Порта для наполнения: можно отбирать 10-мл пипеткой (размер подходит) (но для сосудов большого объема потребуется много повторений). При это ни в коем случае нельзя касаться пипеткой оксигенаторной мембраны (центрального ядра)! Пипетку можно погружать на всю глубину сосуда – до дна.

Также можно (и легче) использовать 50-мл (или меньшего объема) шприцы для отбора через шприцевые порты – это, вероятно, наиболее простой способ отбора. При отборе клеток с помощью шприца необходимо будет перевернуть сосуд и одновременно вытягивать поршень шприца (чтобы жидкость сливалась в шприц в т.ч. с помощью гравитации). Второй кран при этом необходимо открывать для доступа воздуха.

Также можно, например, при необходимости, удалить ¾ среды через порт для наполнения, а остальное (вместе с клетками) забрать с помощью шприца (в этом случае будет потеря небольшой части агрегатов/клеток, плавающих выше основной массы клеток/агрегатов).

Из какого отверстия в HARV отбирать клетки ?

Малые HARV (4 мл, 1 мл): отбор осуществляется только шприцем через шприцевый порт. Можно использовать 5-мл (10-мл) шприц для отбора среды с клетками (всего объема) из крана. Второй кран при этом необходимо открывать для доступа воздуха.

Большие HARV (50 мл, 10 мл): для отбора клеток можно использовать Порт для наполнения (предназначен для добавления среды/клеток и аспирации среды/клеток) пипеткой (10 мл). Не обязательно использовать шприцевые порты для удаления всей среды. При это ни в коем случае нельзя касаться пипеткой оксигенаторной мембраны !

Нужно ли наклонять (и на какой угол) сосуд для того, чтобы отобрать клетки ? 

Да, нужно немного наклонять сосуд, чтобы клетки переместились под пипетку.

Как извлечь из сосуда эксплантат, если он большого размера ?

Шприц вряд ли подойдет для извлечения эксплантата. Д-р Навран: наклонить сосуд так, чтобы эксплантат оказался под портом для заполнения, и «выловить» эксплантат щипцами (осторожно! Нельзя повреждать мембрану!)

Альтернативно можно подсоединить вакуумную линию к пастеровской пипетке, и «присосать» эксплантат к кончику пипетки, чтобы извлечь его из сосуда.

Сосуд HARV-4 вряд ли будет оптимальным для культивирования эксплантата, а больше предназначен для культивирования редких клеток (малых количеств).

Как извлекать сфероиды из сосуда ? Позволит ли диаметр сфероидов после культивирования в сосуде отобрать их с помощью шприца ?

Если диаметр сфероидов больше 200-300 мкм, то, вероятно, они будут иметь некротическое ядро (слишком большие сфероиды). В этом случае, для уменьшения размера сфероидов, следует или использовать STLV (получаемые сфероиды – меньшего диаметра), или снизить концентрацию клеточного посева (с 10⁵).

БОльшая часть сфероидов, получаемых в сосудах, имеет диаметр около 100-150 мкм, и они легко проходят через шприц при отборе.

Можно ли по завершению эксперимента сливать клетки через шприцевый порт (без использования шприцев/пипеток) при открытом втором кране ?

Да, это можно делать, но необходимо учитывать, что весьма возможна контаминация клеток (из-за касания внешних поверхностей) – нарушение стерильности. Внешние поверхности рекомендуется протереть стерильным спиртовым тампоном до этого, но гарантировать стерильность и в этом случае невозможно.

При использовании сосудов HARV следует быть предельно осторожным при использовании пипеток, погружаемых в порт для наполнения! Ни в коем случае нельзя касаться острыми предметами (в т.ч. пластиковой пипеткой, пастеровской пипеткой, шприцем…) поверхности мембраны (внизу сосуда, на нижней половине).

«У меньших сосудов нет порта для наполнения. Соответственно, наполнение этих сосудов должно осуществляться через порты для шприцев.»

При заполнении сосудов HARV-4 мл следует сразу накрутить двухходовые краны для подсоединения шприцев. При заполнении сосуда второй кран должен быть открыт для обеспечения выпуска воздуха.

Заполнять HARV нужно только шприцем, или можно пипеткой ?

Большие сосуды HARV, в который есть порт для наполнения, можно заполнять пипеткой (но можно и через порт для шприцев).

Малые HARV: заполнение проводится только шприцем.

Можно ли добавлять в сосуд HARV малого объема сразу клетки, смешанные с культуральной средой (вместо последовательного добавления в сосуд сначала культуральной среды, а затем клеточной суспензии) ?

Да, можно, решение за пользователем. Д-р Навран добавляет клетки в культуральной среде сразу (напр., объемом четь меньше 4 мл для сосуда HARV-4).

Как заменять культуральную среду в больших сосудах HARV (с портом для наполнения) ?

Ставить сосуд необходимо вертикально (на бок) так, чтобы порт для наполнения был в самой высокой точке (для того, чтобы клетки соскользнули вниз, в сторону, противоположную от порта для наполнения.

Затем наклонить сосуд под небольшим углом, и удалять среду пипеткой через порт для наполнения, осторожно поворачивая сосуд (чтобы отобрать больше среды). Тем не менее, отобрать для освежения всю среду из сосуда невозможно без отбора клеток (возможно отобрать около 2/3 среды). Ни в коем случае нельзя касаться острыми предметами (в т.ч. пластиковой пипеткой, пастеровской пипеткой) поверхности оксигенаторной мембраны.

Как заменять культуральную среду в малых сосудах HARV (без порта для наполнения) ?

Все содержимое сосуда необходимо отобрать с помощью шприца, а затем опустошить шприц в стерильную пробирку. Подождать, пока клетки/сфероиды не осядут на дно пробирки. Затем осторожно аспирировать старую среду сверху клеток, и добавить новую среду. После этого с помощью шприца ввести клетки и среду обратно в сосуд, и удалить любые возникшие пузырьки.

«Поставьте сосуд вертикально, с направленными вверх кранами, и дайте скаффолдам, носителям или клеточным агрегатам осесть на дно.». Обычно сколько времени рекомендуется подождать, пока клетки не осядут ?

Если в культуре образовались сфероиды – может быть достаточно 1-2 минут.

Единичные клетки – рекомендуется подождать до 5-10 минут до их седиментации.

В случае, если в аспирате, даже после 10 минут выдерживания в вертикальном положении, наблюдаются единичные клетки либо маленькие сфероиды, можно увеличить время выдерживания до 15-20 минут.

До начала эксперимента рекомендуется попрактиковаться на воде с целью отработки действий (особенно в части удаления пузырьков)

Требуемые для сосуда краны и шприцы — Luer lock (порты имеют крепления Луэр лок)

Рекомендуется не помещать в сосуд клетки сразу после размораживания: отклик/культивирование будет не таким хорошим, чем если бы сначала прокультивировать их во флаконах, трипсинизировать, а затем поместить в реактор (из-за температурного шока клетки не так хорошо агрегируют в сфероиды)          

Сосуд необходимо полностью заливать жидкостью (средой, клетками)

«Переместите сосуд в вытяжной шкаф с ламинарным потоком. Поместите заглушку порта для наполнения на стерильный тампон, пропитанный спиртом.» Какой стороной класть заглушку на тампон ?

Внутренней (затыкающей) частью на спирт (требуется во избежание контаминации).

Какие требования к спиртовому содержанию тампона ?

Этанол/изопропанол.

Также тампон может понадобиться в случае, если коснуться порта (или иной поверхности, контактирующей с клетками) пальцами: если есть сомнения о возможности контаминации – лучше протереть место касания тампоном.

«Прикрепите стерильные краны (клапаны) к портам для шприцев.» — Можно ли использовать трехходовый кран вместо двухходового ?

Да, можно.

«Частично заполните сосуд средой, оставив достаточно места для добавления клеток и скаффолдов или микроносителей.» – насколько много среды заливать ?

Нет жестких требований/ограничений. Зависит от того, каков объем добавляемой потом клеточной суспензии.

Через какой порт заливать среду? Чем допускается заливать среду (пипеткой, шприцем…) ?

Через порт для наполнения. Заливать можно пипеткой или шприцем. Главное – не касаться оксигенаторного ядра !

Через какой порт заливать среду в HARV-4 ?

Через шприцевый порт. Только шприцем (второй кран должен быть открыт!)

« Добавьте клетки. При желании, клетки и микроносители можно смешивать и добавлять вместе..» — через какой порт добавлять клетки ?

Через порт для наполнения.

Если используются каркасы/носители: рекомендуется перемешать клетки и носители и добавлять их вместе.

Допускается добавление клеток через порты для шприцев (с помощью шприца), в т.ч. для больших сосудов HARV и для сосудов STLV.

«Заполните оставшийся объем сосуда средой и вставьте заглушку порта для наполнения.» – заливать средой необходимо до самого края ?

Да, как только можно больше, но так, чтобы не перелить через край, и так, чтобы затем стала заглушка порта для наполнения.

«Удаление пузырька.»

При удалении пузырьков лучше делать это достаточно медленно.

Под каждым портом есть вогнутая область, и пузырек может там задерживаться, откуда его и выдавливают шприцем.

В случае, если в сосуде образовались пузырьки воздуха, прикрепленные к оксигенаторной мембране или к стенкам сосуда, для их удаления можно открутить сосуд от роторной базы, взять в одну руку сосуд, а другой рукой резко хлопнуть по нему.

Можно ли переворачивать сосуд набок/вверх ногами, чтобы убедиться, что не осталось пузырьков воздуха ?

Да, можно, но делать это следует осторожно.

какого объема шприц использовать для удаления пузырьков:

            — HARV-4

            — HARV-10

            — HARV-50

            — STLV-110

            — STLV-250

Обычно максимальный объем пузырька – несколько мл, поэтому 3-5 мл шприц подходит для всех размеров сосудов. Но если сосуд был недостаточно заполнен средой через порт для наполнения (на предыдущих этапах подготовки), то можно использовать и шприцы большего объема.

При удалении пузырьков шприцем необходимо контролировать, чтобы не ввести воздух в сосуд шприцем (шприц должен быть заполнен достаточным объемом среды).

Окончательное (безвоздушное) заполнение сосуда до краев средой обеспечивается именно введением среды с помощью шприца при выдавливании пузырьков.

После завершения удаления пузырьков и откручивания шприцев от кранов рекомендуется удалить остатки культуральной среды из кранов : 

« Прикрепите сосуд к роторной базе.» — насколько плотно прикручивать сосуд к базе ?

Необходимо без усилий прикручивать сосуд до тех пор, пока он не сядет на ротор плотно (пока прикручивание без усилий не остановится). Затем приложить немного силы, чтобы закрепить сосуд чуть-чуть плотнее (убедиться, что сосуд сидит крепко) – если сосуд не будет прикручен плотно, при вращении он может открутиться. Тем не менее, важно не перетягивать крепление с излишней силой !

«Перед автоклавированием центральные стержневые монтажные болты автоклавируемого сосуда для культивир ования STLV™ должны быть откручены (ослаблены) на один оборот.»

Можно открутить больше, чем на 1 оборот (но так, чтобы сосуд держался вместе). Самое главное – ослабить болт с переднего торца сосуда (с той стороны, где расположены порты).

Болт с заднего торца сосуда удерживает оксигенаторное ядро, и его не обязательно ослаблять.

То же самое касается HARV – можно открутить больше, чем на 1 оборот.

«Снимите заглушку порта для наполнения и автоклавируйте отдельно от сосуда –нужно ли вынимать заглушку полностью ?

Ее можно вынимать полностью. Тогда заглушку порта для наполнения следует обернуть фольгой перед стерилизацией.

Или же можно почти полностью вынуть ее так, чтобы не помещать уплотнительные кольца внутрь сосуда (так снижается риск контаминации), и автоклавировать сосуд в сборе.

«Поместите сосуд и заглушку порта в автоклавный мешок или оберните фольгой и автоклавируйте при температуре 121 °C в течение 20 минут». Имеется в виду обычная фольга ?

Да, обычная алюминиевая фольга.

Стерилизация HARV идет точно так же, как описано для STLV ? Просто вынимаем заглушку порта для наполнения ?

Да. Главное – не забыть ослабить винты !

Нужно ли извлекать шприцевые порты из корпуса сосуда и автоклавировать их отдельно от сосуда ?

Нет, не нужно извлекать шприцевые порты из корпуса сосуда до автоклавирования. Необходимо лишь накрыть отверстия шприцевых портов до автоклавирования (по инструкции: Наденьте пластмассовые заглушки или алюминиевую фольгу на порты для шприцев).

Можно ли высушивать сосуды в автоклаве после завершения 20-минутного цикла автоклавирования ?

Не рекомендуется высушивать сосуды в автоклаве после завершения 20-минутного цикла автоклавирования. По завершении данного цикла автоклавирования сосуд необходимо извлечь из актовлава. Учитывая, что пластик может плавиться при высоких температурах, а температура в автоклаве – сдвигаться (повышаться), достижение достаточно высоких температур может расплавить сосуд.

Очистку сосудов нужно проводить каждый раз после завершения инкубации (эксперимента), незамедлительно: промыть под водой, замочить в детергенте.

Можно не откручивать мембрану (оксигенаторное ядро) STLV при очистке сосуда. Болт с переднего торца держит стенку сосуда, и она снимается. Болт с заднего торца держит мембрану, и можно не снимать мембрану с болта при очистке (промывать как одно целое) – это снизит риск повреждения мембраны/ядра при неправильном откручивании и неправильном хвате (удерживании) мембраны при этом.

Чем и как можно касаться мембраны и ядра ?

Можно касаться пальцами в перчатках (главное – ничего острого).

Как браться за ядро ? Не брать за середину мембраны (ядра) !

Если снимать ядро с заднего болта, то очень важно не скручивать ядро пальцами (не сдвигать мембрану сильным усилием)! Поэтому рекомендует не снимать ядро (д-р Навран не снимает.) – это не влияет на чистоту. Можно в этом случае оставить ядро (и остальные части сосуда) замоченным в детергенте на ночь.

Если снимать мембрану (ядро) – нужно стараться держать ее почти с торцов там, где нет мембраны.

Какой детергент можно использовать ?

Любой лабораторный детергент подойдет (но см. ограничения по кислотам… в руководстве). Например, детергент (мыло), который используют для лабораторного стекла.

Детергент необходимо смывать тщательно.

«Мягкой щеткой очистите пластмассовые части (кроме оксигенаторного ядра) для удаления любых остатков (осаждений) на них.» Какая щетка подходит ?

Любая лабораторная щетка. Не металлическая. Например, какой моют стекло в лаборатории.

“Осторожно очистите оксигенаторное ядро кончиком пальца, используя лабораторные латексные перчатки». Как очищать мембрану/ядро ?

Очищать ядро только с наружной (видимой) стороны.

Очень осторожно протереть пальцами в перчатках (чтобы удалить белковые остатки с мембраны). Промывать пальцами, смоченными в детергенте.

«Высушите части сосуда воздухом.» — дать высохнуть на воздухе, или надо обдувать сжатым воздухом ?

Просто высушивать на воздухе.

Как проводить очистку сосуда HARV ?

Следует открутить все винты по периметру торца, разъединить 2 половины сосуда. Нижнюю часть сосуда (с установленной оксигенаторной мембраной) допускается очищать только пальцами в перчатках (очень осторожно), без использования щетки. Верхнюю часть следует очищать щеткой так, как описано для STLV. В остальном процедура очистки (замачивание в детергенте…) не отличается от STLV.

Нужно ли извлекать шприцевые порты из корпуса сосуда и очищать их отдельно от сосуда ?

Это можно делать, но это не является необходимым действием. Хорошей практикой поддержания чистоты является извлечение и очистка шприцевых портов от времени к времени, но не после каждого использования. Если говорить о конкретном графике очистке, можно посоветовать график: через каждые 10 применений сосуда.

Кто должен подписать Green Warranty form ?

Оригинал Гарантийной формы должен подписать конечный пользователь.

Данный документ будет отправлен в Синтекон

Как дезинфицировать / протирать части биореактора при первом получении груза и перед его установкой в лаборатории ?

Очистить роторную базу и блок питания: изопропанол 70% — протереть тряпочкой, смоченной в изопропаноле. Сосуды автоклавируемы, поэтому их очищать не нужно таким способом.

На какой высоте от края сосуда должен быть суспендирован слой клеток при вращении? Как регулировать скорость вращения: например, слой клеток вырос, и опустился вниз: насколько увеличивать скорость ?

Основная задача: Клетки должны оставаться в суспензии и не касаться внутренней стенки сосуда.

Начальную скорость вращения ставить чуть меньше 10 об/мин. Можно ставить 7-8 об/мин. Затем увеличить до 10 об/мин после роста сфероида. Часто в экспериментах с клетками и агрегатами скорость не увеличивают больше 10 об/мин.

Опорно-зависимые клетки: агрегируют в сфероиды, и будут осаждаться быстрее (скорость осаждения возрастает с ростом сфероида). Первоначально, как единичные клетки, они осаждаются очень медленно, поэтому нет необходимости в большой скорости вращения, чтобы удерживать их в суспензии. По мере их агрегации – нужно будет увеличивать скорость вращения. Сфероиды будет видны невооруженным глазом: если наблюдается, что сфероиды катаются по поверхности сосуда, нужно увеличить скорость вращения.

Скорость легко увеличить правильно (визуально видно всю культуру клеток через прозрачную стенку сосуда).

В случае использования каркасов/носителей: нужно удерживать каркасы в суспензии (клетки прикрепятся к каркасам) – можно ориентироваться на суспендирование каркасов. При использовании очень больших каркасов (напр., размером 5 мм) скорость может быть увеличена до 12-15 об/мин.

Каждый день необходимо контролировать скорость вращения (клетки должны быть в суспензии): осаждение из-за роста агрегатов не происходит очень быстро (интервал не часов, а дней).

По крайней мере 1 раз в день необходимо контролировать, чтобы в сосуде не было пузырьков (приводят к стрессу из-за силы сдвига, и препятствуют образованию агрегатов и влияют на клетки)! В сосуде идет газообмен, клетки дышат (производят СО₂), и образуются пузырьки. Иногда это может быть маленький пузырек, находящийся сверху. Было замечено, что через несколько дней образование пузырьков замедляется, и они могут больше не появляться. Формирование пузырьков в процессе культивирования зависит во многом от типа клеточной культуры, ее метаболизма (бывает, что пузырьки (почти) не образуются) в процессе инкубирования).

Сколько клеток добавлять в сосуд первоначально (концентрация) ?

Важна концентрация (клеток/мл): если пытаемся вызвать агрегацию клеток – Синтекон рекомендует добавлять 10⁵ клеток/мл. Безусловно, это зависит от типа клеток (напр.: определенные клетки требуют больше кислорода), но в целом для получения сфероидов требуется 10⁵ клеток/мл для относительно быстрого формирования хороших сфероидов. Сначала будет много маленьких сфероидов, и они будут расти со временем. Со временем сфероиды стабилизируются в размере, поскольку приходят к моменту, когда не могут эффективно транспортировать кислород в центр сфероида.

Если используются каркасы – вероятно, можно использовать меньшую концентрацию.

Слишком большая концентрация клеток: сфероиды вырастут слишком большими, и могут получить гипоксию в центре, т.е. получится некротическое ядро при слишком большом размере (даже наблюдалась агрегация всех клеток в один гигантский комок), что может привести к смерти культуры.

Это универсальная рекомендация для всех объемов сосудов.

Больший объем сосудов: для получения большего числа сфероидов. Очень маленькие сосуды: для редких клеток (получаемых в небольших количествах), т.к. малое число клеток никогда не сформирует агрегаты/сфероиды из-за разбавления. Напр., 1 мл: часто используют для стволовых клеток.

Можно, например, последовательно инкубировать сначала в сосуде малого объема, затем переносить в сосуд большего объема.

HARV формирует сфероиды несколько большего размера, чем STLV. В STLV оксигенаторное ядро не позволяет формировать большие агрегаты в центре. Т.е. если, например, в HARV агрегаты слишком большие, можно перейти на STLV, чтобы получить меньшего диаметра, более однородные сфероиды, чем в HARV (есть статья об этом на эмбриональных стволовых клетках).

Сколько дней можно культивировать клетки в сосуде? Есть ли ограничения? (в т.ч. сколько дней может ротор стоять в инкубаторе ?

Не то же время, что в культуральных флаконах (во флаконах при покрытии всей поверхности флакона они станут отрываться от поверхности – confluence) – больше.

Если агрегаты очень большие – может появиться некроз; но очень часто сфероиды стабилизируются в размере, и их можно выращивать в сосуде неделями (даже до 1 месяца) без возникновения проблем.

Можно помещать в сосуды эксплантаты (кусочки тканей) – они растут и до 2 месяцев без некроза.

В отношении ротора: пока он включен (вращает) в инкубаторе, ограничений для нахождения в инкубаторе нет (нагрев при вращении предотвращает повреждение мотора).

Как только ротор выключают (завершается эксперимент), его необходимо извлекать из инкубатора.

Очень важно поддерживать надлежащее увлажнение в инкубаторе (по инструкции производителя инкубатора) !

Как часто следует менять культуральную среду в сосуде ?

Культуральную среду следует менять приблизительно так же часто, как и в случае культивирования в культуральном флаконе. В случае, если в состав среды входит рН-индикатор (напр., феноловый красный), то изменение цвета (закисление среды) может служить указателем на необходимость замены.

В целом культуральную среду следует менять каждый 2-й день (каждый 3-й день).

Как часто следует 0.22-мкм фильтр, расположенный на задней стороне роторной базы ?

Фильтр на задней стороне роторной базы рекомендуется менять по следующему графику:

1. Если прибор используется постоянно, то фильтр необходимо менять каждые 6 месяцев
2. Если прибор используется умеренно, то фильтр необходимо менять каждые 12 месяцев

Спецификация фильтра:

Артикул:SLFG05010

Millex-FG, 0.20 µm, hydrophobic PTFE, 50 mm