Технологии
Жизни
ООО "Селл Диагностик"
EngАдрес офиса: 220040, г. Минск, ул. Максима Богдановича, д.120, пом. 5 Пн.-Пт.: 09:00 - 18:00
Оригинал Гарантийной формы должен подписать конечный пользователь.
Данный документ будет отправлен в Синтекон
Очистить роторную базу и блок питания: изопропанол 70% — протереть тряпочкой, смоченной в изопропаноле. Сосуды автоклавируемы, поэтому их очищать не нужно таким способом.
Основная задача: Клетки должны оставаться в суспензии и не касаться внутренней стенки сосуда.
Начальную скорость вращения ставить чуть меньше 10 об/мин. Можно ставить 7-8 об/мин. Затем увеличить до 10 об/мин после роста сфероида. Часто в экспериментах с клетками и агрегатами скорость не увеличивают больше 10 об/мин.
Опорно-зависимые клетки: агрегируют в сфероиды, и будут осаждаться быстрее (скорость осаждения возрастает с ростом сфероида). Первоначально, как единичные клетки, они осаждаются очень медленно, поэтому нет необходимости в большой скорости вращения, чтобы удерживать их в суспензии. По мере их агрегации – нужно будет увеличивать скорость вращения. Сфероиды будет видны невооруженным глазом: если наблюдается, что сфероиды катаются по поверхности сосуда, нужно увеличить скорость вращения.
Скорость легко увеличить правильно (визуально видно всю культуру клеток через прозрачную стенку сосуда).
В случае использования каркасов/носителей: нужно удерживать каркасы в суспензии (клетки прикрепятся к каркасам) – можно ориентироваться на суспендирование каркасов. При использовании очень больших каркасов (напр., размером 5 мм) скорость может быть увеличена до 12-15 об/мин.
Каждый день необходимо контролировать скорость вращения (клетки должны быть в суспензии): осаждение из-за роста агрегатов не происходит очень быстро (интервал не часов, а дней).
По крайней мере 1 раз в день необходимо контролировать, чтобы в сосуде не было пузырьков (приводят к стрессу из-за силы сдвига, и препятствуют образованию агрегатов и влияют на клетки)! В сосуде идет газообмен, клетки дышат (производят СО2), и образуются пузырьки. Иногда это может быть маленький пузырек, находящийся сверху. Было замечено, что через несколько дней образование пузырьков замедляется, и они могут больше не появляться. Формирование пузырьков в процессе культивирования зависит во многом от типа клеточной культуры, ее метаболизма (бывает, что пузырьки (почти) не образуются) в процессе инкубирования).
Важна концентрация (клеток/мл): если пытаемся вызвать агрегацию клеток – Синтекон рекомендует добавлять 105 клеток/мл. Безусловно, это зависит от типа клеток (напр.: определенные клетки требуют больше кислорода), но в целом для получения сфероидов требуется 105 клеток/мл для относительно быстрого формирования хороших сфероидов. Сначала будет много маленьких сфероидов, и они будут расти со временем. Со временем сфероиды стабилизируются в размере, поскольку приходят к моменту, когда не могут эффективно транспортировать кислород в центр сфероида.
Если используются каркасы – вероятно, можно использовать меньшую концентрацию.
Слишком большая концентрация клеток: сфероиды вырастут слишком большими, и могут получить гипоксию в центре, т.е. получится некротическое ядро при слишком большом размере (даже наблюдалась агрегация всех клеток в один гигантский комок), что может привести к смерти культуры.
Это универсальная рекомендация для всех объемов сосудов.
Больший объем сосудов: для получения большего числа сфероидов. Очень маленькие сосуды: для редких клеток (получаемых в небольших количествах), т.к. малое число клеток никогда не сформирует агрегаты/сфероиды из-за разбавления. Напр., 1 мл: часто используют для стволовых клеток.
Можно, например, последовательно инкубировать сначала в сосуде малого объема, затем переносить в сосуд большего объема.
HARV формирует сфероиды несколько большего размера, чем STLV. В STLV оксигенаторное ядро не позволяет формировать большие агрегаты в центре. Т.е. если, например, в HARV агрегаты слишком большие, можно перейти на STLV, чтобы получить меньшего диаметра, более однородные сфероиды, чем в HARV (есть статья об этом на эмбриональных стволовых клетках).
Не то же время, что в культуральных флаконах (во флаконах при покрытии всей поверхности флакона они станут отрываться от поверхности – confluence) – больше.
Если агрегаты очень большие – может появиться некроз; но очень часто сфероиды стабилизируются в размере, и их можно выращивать в сосуде неделями (даже до 1 месяца) без возникновения проблем.
Можно помещать в сосуды эксплантаты (кусочки тканей) – они растут и до 2 месяцев без некроза.
В отношении ротора: пока он включен (вращает) в инкубаторе, ограничений для нахождения в инкубаторе нет (нагрев при вращении предотвращает повреждение мотора).
Как только ротор выключают (завершается эксперимент), его необходимо извлекать из инкубатора.
Очень важно поддерживать надлежащее увлажнение в инкубаторе (по инструкции производителя инкубатора) !
Культуральную среду следует менять приблизительно так же часто, как и в случае культивирования в культуральном флаконе. В случае, если в состав среды входит рН-индикатор (напр., феноловый красный), то изменение цвета (закисление среды) может служить указателем на необходимость замены.
В целом культуральную среду следует менять каждый 2-й день (каждый 3-й день).
Фильтр на задней стороне роторной базы рекомендуется менять по следующему графику:
Артикул:SLFG05010
Millex-FG, 0.20 µm, hydrophobic PTFE, 50 mm