Главная / Часто задаваемые вопросы Synthecon / Общие вопросы

Общие вопросы

Кто должен подписать Green Warranty form ?

Оригинал Гарантийной формы должен подписать конечный пользователь.

Данный документ будет отправлен в Синтекон

Как дезинфицировать / протирать части биореактора при первом получении груза и перед его установкой в лаборатории ?

Очистить роторную базу и блок питания: изопропанол 70% — протереть тряпочкой, смоченной в изопропаноле. Сосуды автоклавируемы, поэтому их очищать не нужно таким способом.

На какой высоте от края сосуда должен быть суспендирован слой клеток при вращении? Как регулировать скорость вращения: например, слой клеток вырос, и опустился вниз: насколько увеличивать скорость ?

Основная задача: Клетки должны оставаться в суспензии и не касаться внутренней стенки сосуда.

Начальную скорость вращения ставить чуть меньше 10 об/мин. Можно ставить 7-8 об/мин. Затем увеличить до 10 об/мин после роста сфероида. Часто в экспериментах с клетками и агрегатами скорость не увеличивают больше 10 об/мин.

Опорно-зависимые клетки: агрегируют в сфероиды, и будут осаждаться быстрее (скорость осаждения возрастает с ростом сфероида). Первоначально, как единичные клетки, они осаждаются очень медленно, поэтому нет необходимости в большой скорости вращения, чтобы удерживать их в суспензии. По мере их агрегации – нужно будет увеличивать скорость вращения. Сфероиды будет видны невооруженным глазом: если наблюдается, что сфероиды катаются по поверхности сосуда, нужно увеличить скорость вращения.

Скорость легко увеличить правильно (визуально видно всю культуру клеток через прозрачную стенку сосуда).

В случае использования каркасов/носителей: нужно удерживать каркасы в суспензии (клетки прикрепятся к каркасам) – можно ориентироваться на суспендирование каркасов. При использовании очень больших каркасов (напр., размером 5 мм) скорость может быть увеличена до 12-15 об/мин.

Каждый день необходимо контролировать скорость вращения (клетки должны быть в суспензии): осаждение из-за роста агрегатов не происходит очень быстро (интервал не часов, а дней).

По крайней мере 1 раз в день необходимо контролировать, чтобы в сосуде не было пузырьков (приводят к стрессу из-за силы сдвига, и препятствуют образованию агрегатов и влияют на клетки)! В сосуде идет газообмен, клетки дышат (производят СО₂), и образуются пузырьки. Иногда это может быть маленький пузырек, находящийся сверху. Было замечено, что через несколько дней образование пузырьков замедляется, и они могут больше не появляться. Формирование пузырьков в процессе культивирования зависит во многом от типа клеточной культуры, ее метаболизма (бывает, что пузырьки (почти) не образуются) в процессе инкубирования).

Сколько клеток добавлять в сосуд первоначально (концентрация) ?

Важна концентрация (клеток/мл): если пытаемся вызвать агрегацию клеток – Синтекон рекомендует добавлять 10⁵ клеток/мл. Безусловно, это зависит от типа клеток (напр.: определенные клетки требуют больше кислорода), но в целом для получения сфероидов требуется 10⁵ клеток/мл для относительно быстрого формирования хороших сфероидов. Сначала будет много маленьких сфероидов, и они будут расти со временем. Со временем сфероиды стабилизируются в размере, поскольку приходят к моменту, когда не могут эффективно транспортировать кислород в центр сфероида.

Если используются каркасы – вероятно, можно использовать меньшую концентрацию.

Слишком большая концентрация клеток: сфероиды вырастут слишком большими, и могут получить гипоксию в центре, т.е. получится некротическое ядро при слишком большом размере (даже наблюдалась агрегация всех клеток в один гигантский комок), что может привести к смерти культуры.

Это универсальная рекомендация для всех объемов сосудов.

Больший объем сосудов: для получения большего числа сфероидов. Очень маленькие сосуды: для редких клеток (получаемых в небольших количествах), т.к. малое число клеток никогда не сформирует агрегаты/сфероиды из-за разбавления. Напр., 1 мл: часто используют для стволовых клеток.

Можно, например, последовательно инкубировать сначала в сосуде малого объема, затем переносить в сосуд большего объема.

HARV формирует сфероиды несколько большего размера, чем STLV. В STLV оксигенаторное ядро не позволяет формировать большие агрегаты в центре. Т.е. если, например, в HARV агрегаты слишком большие, можно перейти на STLV, чтобы получить меньшего диаметра, более однородные сфероиды, чем в HARV (есть статья об этом на эмбриональных стволовых клетках).

Сколько дней можно культивировать клетки в сосуде? Есть ли ограничения? (в т.ч. сколько дней может ротор стоять в инкубаторе ?

Не то же время, что в культуральных флаконах (во флаконах при покрытии всей поверхности флакона они станут отрываться от поверхности – confluence) – больше.

Если агрегаты очень большие – может появиться некроз; но очень часто сфероиды стабилизируются в размере, и их можно выращивать в сосуде неделями (даже до 1 месяца) без возникновения проблем.

Можно помещать в сосуды эксплантаты (кусочки тканей) – они растут и до 2 месяцев без некроза.

В отношении ротора: пока он включен (вращает) в инкубаторе, ограничений для нахождения в инкубаторе нет (нагрев при вращении предотвращает повреждение мотора).

Как только ротор выключают (завершается эксперимент), его необходимо извлекать из инкубатора.

Очень важно поддерживать надлежащее увлажнение в инкубаторе (по инструкции производителя инкубатора) !

Как часто следует менять культуральную среду в сосуде ?

Культуральную среду следует менять приблизительно так же часто, как и в случае культивирования в культуральном флаконе. В случае, если в состав среды входит рН-индикатор (напр., феноловый красный), то изменение цвета (закисление среды) может служить указателем на необходимость замены.

В целом культуральную среду следует менять каждый 2-й день (каждый 3-й день).

Как часто следует 0.22-мкм фильтр, расположенный на задней стороне роторной базы ?

Фильтр на задней стороне роторной базы рекомендуется менять по следующему графику:

Если прибор используется постоянно, то фильтр необходимо менять каждые 6 месяцев
Если прибор используется умеренно, то фильтр необходимо менять каждые 12 месяцев

Спецификация фильтра:

Артикул:SLFG05010

Millex-FG, 0.20 µm, hydrophobic PTFE, 50 mm